葡萄的品质容易受到低温胁迫的影响，而耐寒野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制是葡萄遗传改良的重要因素。WRKY转录因子在冷胁迫的响应中扮演着重要角色，它通过结合W-box元件而调节包括次生代谢和碳水化合物合成在内的多个生物过程。在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），将淀粉分解为可溶性糖，从而调节渗透压，稳定细胞结构，并直接调控过氧化物酶（VaPOD36）以清除活性氧（ROS），增强耐寒性。然而，VaWRKYs在葡萄耐寒方面的具体功能和机制仍需深入探讨。

近期在《Horticulture Research》上发表的一项研究显示，VaWRKY65在冷胁迫条件下通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制显著增强葡萄的耐寒性。研究发现，VaWRKY65通过激活VaBAM3，促进可溶性糖的积累，进而调节渗透压。同时，VaWRKY65也能激活VaPOD36的转录，清除ROS，为葡萄提供双重的耐寒保护。

研究采用了烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，检测后发现VaBAM3启动子的活性在冷处理下显著升高。通过酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，团队揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制，并发现VaWRKY65通过提升VaBAM3启动子的活性来增强耐寒性，而启动子的突变则会抑制该增强效果。

此外，通过双荧光素酶系统的实验，研究确定了VaWRKY65在冷胁迫下对ROS的调控机制。结果显示，VaWRKY65能够结合并激活VaPOD36的表达，上调VaPOD36将提高POD酶的活性，增强植物的抗氧化能力，从而减少ROS积累，提高植物的整体耐寒性。

为实现这些实验，提高生物医学研究的效果，研究团队采用基因启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合的技巧，将其转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体转入本氏烟草叶片。经过2天的共培养后（25℃），在低温条件下培养72小时（4℃），观察LUC荧光时，喷洒1mM D-荧光素溶液，并在黑暗中放置5分钟，通过勤翔IVScope7000植物活体成像系统检测荧光并分析数据。

通过这项研究，可以看到尊龙凯时在冷胁迫下葡萄耐寒性的多重调控机制，期待其为葡萄品种改良提供新的思路，推动生物医学领域的发展与研究。